1. 常用柱型

反相C18柱（最常用）

主要機理：以疏水作用為主，多肽氨基酸殘基（尤其是疏水性殘基）與C18固定相親和，極性較強的多肽流出較快，疏水性強的多肽保留時間長。

流動相：通常采用水+有機溶劑（乙腈ACN或者甲醇MeOH），加適量酸（如0.1%三氟乙酸TFA、0.1%甲酸）有助于提高峰形和抑制二級結構形成。

粒徑：分析級常選1.7–5μm，UPLC用更小粒徑，制備級可用更大粒徑。

反相C8柱

鏈長略短（八烷基），疏水性比C18弱，部分小肽或極性更高的肽類用C8分離更適合。

親水相互作用色譜（HILIC）柱

偶用于高極性、小分子多肽、親水肽段，分離補充反相法。

2. 選擇理由

多肽分子疏水和親水殘基兼具，一般反相柱對不同疏水性多肽保留分辨能力強，適用面寬；

多肽在正相色譜（如硅膠）及離子交換色譜上，分離選擇性不如反相柱直接、通用，且正相色譜對生物樣品適應性差；

可與紫外檢測（214 nm、220 nm等）和質譜（MS）兼容——反相流動相無需高濃度鹽，且揮發性好，利于MS聯用。

3. 實驗注意要點

柱溫一般調至30°C–60°C以減少多肽二級結構影響；

多肽樣品勿溶于高濃度鹽或雜質含量高的緩沖液，否則易污染色譜柱；

若為極高分辨率（如肽指紋圖譜、肽同分異構體分離），可選小粒徑（如1.7 μm UPLC柱）或長柱。

4. 補充：制備分離時

依然以大內徑C18反相柱為主，但流速和柱尺寸增大。

對于特殊大/小肽或結構特殊肽段，也可能選用離子交換色譜、凝膠色譜等其他類型分離手段。